不溶性微粒檢測儀—MFI（微流成像顆粒分析系統(tǒng)）技術(shù)原理及應(yīng)用分享
不溶性微粒檢測必要性
不溶性微粒（英文：Sub-visible Particle/particulate matter），指不溶于水和有機溶劑，非代謝性的，肉眼所看不見的顆粒物。粒徑范圍一般在2-50μm之間，主要來源于藥品生產(chǎn)、儲存、運輸過程及臨床配藥操作污染等途徑以及藥物配伍使用時發(fā)生物理或化學(xué)性質(zhì)的變化。由于不溶性微粒不能在體內(nèi)代謝，極少量的不溶性顆粒都會激活非特異的免疫應(yīng)答，增加潛在的免疫原性，進入血管會引起阻塞，產(chǎn)生肉芽腫、靜脈炎、血栓以及組織壞死。因此各國藥典對不溶性微粒分別制定了嚴格的判定標準，中國藥典2020版0903章節(jié)不溶性微粒檢測法與國際檢測標準保持一致，第一法為光阻法，第二法為顯微計數(shù)法。
中國藥典2020版規(guī)定對于黏度過高和易析出結(jié)晶的制劑，以及進入傳感器時容易產(chǎn)生氣泡的注射劑，光阻法不適用，應(yīng)以顯微計數(shù)法的測定結(jié)果作為判定依據(jù)。而且光阻法只能對顆粒的大小和濃度進行檢測，對于透光性高的顆粒以及顆粒的形狀無法表征，對樣品中顆粒信息了解非常有限；而顯微計數(shù)法需要經(jīng)過抽濾、烘干處理，使得顆粒形態(tài)與在制劑配方中存在一定的差異。由于藥典檢測方法的局限性，美國藥典 <1787>將微流成像分析技術(shù)推薦作為不溶性微粒大小和形態(tài)的表征。
不溶性微粒檢測工具
微流成像顆粒分析系統(tǒng) MFI 由數(shù)字顯微技術(shù)、微流體和圖像處理技術(shù)整合成一個全自動分析顆?；蚣毎膬x器。當(dāng)樣品流過檢測區(qū)時，高頻成像檢測器會動態(tài)連續(xù)檢測樣品中的顆粒，每個顆粒將被分析，生成關(guān)于顆粒的數(shù)量、尺寸、透明度、形態(tài)等方面的數(shù)據(jù)。通過軟件對顆粒數(shù)據(jù)照片進行相應(yīng)的歸類和計數(shù)分析。
微流成像顆粒分析系統(tǒng) MFI 廣泛應(yīng)用于對生物大分子制劑開發(fā)、穩(wěn)定性評價、包材篩選等生產(chǎn)過程中；同時在細胞和基因治療中助力生產(chǎn)工藝進行質(zhì)控、病毒載體工藝開發(fā)、病毒載體穩(wěn)定性研究等方面；此外對各類疫苗的開發(fā)和穩(wěn)定性評價也發(fā)揮其作用。
MFI應(yīng)用案例
1、RNA藥物制劑開發(fā)
2020年德國CureVac公司Fabian Johannes EBER , Benyamin YAZDAN PANAH等人利用MFI檢測長鏈RNA在采用不同工藝參數(shù)制備凍干，復(fù)溶后亞可見顆粒的情況。并為該工藝申請專利。（專利號：US20200383919A1）。因為RNA穩(wěn)定性極差，極易被廣泛存在的核糖核酸酶或二價陽離子降解。所以通常RNA溶液會貯存在-20℃，甚至是-80℃條件下。如此條件成本太高，在運輸和貯存過程中，也無法時刻保持溫度恒定。因此，廣泛采用冷凍干燥法貯存RNA，以提高其穩(wěn)定性、耐熱性和保質(zhì)期。MFI（Micro-Flow Imaging）微流成像顆粒分析方法對凍干以及復(fù)溶后的亞可見顆粒檢測具有更高準確性和鑒別能力，適合RNA藥物治療產(chǎn)品中微粒分析，用于工藝優(yōu)化和制劑評價，提高產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性。
2、基因治療—AAV生產(chǎn)超濾工藝中顆粒監(jiān)測
AAV作為基因治療載體，其生產(chǎn)過程中超濾環(huán)節(jié)是將AAV濃縮并置于最終制劑配方緩沖液。作為生產(chǎn)工藝中關(guān)鍵步驟，需對該工藝過程進行顆粒監(jiān)控。美國Voyager Therapeutics公司利用MFI研究AAV2和AAV9兩個血清型病毒載體，助力其在濃縮超濾工藝開發(fā)過程中產(chǎn)生的亞可見顆粒的檢測。結(jié)果顯示1-10 μm之間顆粒存在明顯差異。兩個批次A和B實驗對于特定的膜批次，當(dāng)處理時間較長時，亞可見顆粒濃度較高。與較低TMP（跨膜壓差）6.5 psig相比，當(dāng)采用更高TMP（20 psig）進行超濾時，亞可見顆粒濃度降低。MFI具備自動進樣系統(tǒng)，一次可自動檢測多達90個樣品，非常適合AAV生產(chǎn)過程中工藝優(yōu)化。
3、重組蛋白疫苗—鋁佐劑制劑開發(fā)
圖2. 用MFI檢測(n=3) 0.25mg/ml磷酸鋁配方在5 mM琥珀酸中顆粒數(shù)，研究不同pH值對粒徑大小(1-2 μm，≥2 μm)顆粒的影響。1-2 μm顆粒數(shù)/mL(深灰色), ≥2 μm顆粒數(shù)/mL(淺灰色)，1-2至2μm顆粒數(shù)/mL(黑圈)。數(shù)據(jù)報告為平均顆粒計數(shù)或比值±SD (n=3)
鋁鹽被廣泛用作佐劑，以增強T細胞對純白蛋白和亞單位疫苗的反應(yīng)，來自輝瑞公司藥物研發(fā)部科學(xué)家利用MFI評估制劑配方條件對含鋁佐劑疫苗可再懸浮性的影響。離子強度、PH和抗原濃度會顯著影響顆粒大小和再分散。結(jié)果顯示，無抗原的磷酸鋁佐劑內(nèi)的顆粒粒徑和PH值相關(guān)。與pH=4和6相比，當(dāng)pH=5時，≥2 μm顆粒濃度有明顯增加，因磷酸鋁顆粒的相互作用增強，進而導(dǎo)致≥2 μm顆粒數(shù)增加。
參考文獻
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