【技術(shù)速遞】Maurice CE-SDS快速表征LVV慢病毒載體
免疫療法正在發(fā)展成為一種可用于多種惡性腫瘤的有效且侵入性較小的治療方法。慢病毒載體(Lentiviral vectors，LVV) 因其能夠穩(wěn)定地整合相對較大的外源DNA，并且有效地轉(zhuǎn)導分裂細胞和非分裂細胞，已成為免疫治療領(lǐng)域中具有廣泛應用前景的明星載體工具1，2。迄今為止，已有超過315種基于LVV的基因療法正在臨床試驗中3。
臨床應用對慢病毒載體具有較高的質(zhì)量要求，如何確保產(chǎn)品的安全性和有效性始終是質(zhì)量控制的核心。傳統(tǒng)的純度檢測方法SDS-PAGE是一種手動且勞動密集型的方法，通常還伴隨著重現(xiàn)性差的問題，而ELISA方法也存在高估感染性病毒滴度的問題。因此為了加快LVV產(chǎn)品的開發(fā)，迫切需要更加穩(wěn)定、準確及可靠的表征分析工具保證其安全性及有效性。
Maurice是ProteinSimple開發(fā)的一款完全集成的毛細管電泳(CE)分析平臺，兼具分析蛋白質(zhì)大小異質(zhì)性的CE-SDS和蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性的icIEF。免組裝卡盒設(shè)計使得兩種應用切換非常方便。對于高通量應用，可使用僅需5.5分鐘/針的Turbo CE-SDS?卡盒即可獲得CE-SDS數(shù)據(jù)，如果需要進一步表征，則使用25分鐘/針的CE-SDS PLUS卡盒即可獲得可重復的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，不同實驗室之間可進行無縫方法轉(zhuǎn)移。Maurice CE-SDS能同時表征LVV三大關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）：純度、滴度和鑒別。
唯一一款iCIEF和CE-SDS雙藥典設(shè)備
Maurice CE-SDS PLUS分析LVV純度的日內(nèi)重復性
圖1：45針樣品連續(xù)進樣的電泳疊圖（A）及模擬膠圖（B）
為了評估CE-SDS PLUS方法的日內(nèi)重復性，單個LVV樣品連續(xù)進樣45針，結(jié)果顯示盡管LVV結(jié)構(gòu)復雜，但顯示出出色的重現(xiàn)性，平均總峰面積的RSD值僅為2.91%（圖1A），并且Compass for iCE軟件還可生成模擬膠圖(圖1B)，有利于將大型數(shù)據(jù)集進行可視化分析。
Maurice CE-SDS PLUS分析LVV純度的日間重復性
圖2：連續(xù)3天3個LVV樣品重復進樣6針的電泳疊圖（A）及模擬膠圖（B）
為了評估CE-SDS PLUS方法的日間重復性，連續(xù)3天每天制備3個不同的LVV樣本，每個樣本在Maurice上運行6個重復，共進樣54針。所有54個樣本的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性結(jié)果顯示出卓越的重現(xiàn)性，平均總峰面積的RSD值為3.38%（圖2A）。
LVVs的線性、LOD和LOQ測定
圖3：LVVs的線性（A）、LOD和LOQ測定（B）
為了確定該方法的線性和檢測限，對LVV樣品進行連續(xù)稀釋進樣。結(jié)果顯示峰面積隨著樣品濃度的增加而增加（圖3A），且呈線性相關(guān)，R2值為0.98（圖3B）。并使用該稀釋方法確定了檢出限LOD和定量限LOQ分別是1.43x109TU/mL和4.34x109TU/mL，LOD的計算方法是將峰高的標準差除以校準曲線的斜率，LOQ是使用峰高標準差的10倍除以斜率。
LVVs病毒滴度測定
圖4：p24加標測定LVV病毒滴度
p24蛋白測定是確定LVV病毒滴度的主要方法之一，在本研究中，在LVV中加入不同濃度的p24，并進行CE-SDS分析，結(jié)果顯示隨著p24濃度的增加，p24峰值強度明顯增加（圖4A）。利用峰面積對p24濃度進行滴定曲線繪制，發(fā)現(xiàn)峰面積與p24濃度呈正相關(guān)，R2值為0.9848 (圖4B)。與《自然》雜志發(fā)表的105TU LVV中檢測到1 ng p24相比，本研究中109TU/mL的LVV中能檢測到的p24濃度約為8.5μg/mL，在理論值的15%以內(nèi)。
LVVs的鑒別
圖5：不同LVV顆粒的鑒別
LVV載體的鑒別對于確保LVV一致性至關(guān)重要，Maurice CE-SDS可快速的對不同的LVV載體進行鑒別，區(qū)分出不同LVV的相似點和不同點（5A），為相應質(zhì)量標準的建立提供有力依據(jù)。
總結(jié)
LVV載體的鑒別對于確保LVV一致性至關(guān)重要，Maurice CE-SDS可快速的對不同的LVV載體進行鑒別，區(qū)分出不同LVV的相似點和不同點（5A），為相應質(zhì)量標準的建立提供有力依據(jù)。
參考文獻
1. Milone, M. C., & O’Doherty, U. (2018). Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia, 32(7), 1529–1541. https://doi.org/10.1038/s41375- 018-0106-0
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3. Bulcha, J.T., Wang, Y., Ma, H. et al (2021). Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Sig Transduct Target Ther 6, 53 https://doi.org/10.1038/s41392-021-00487-6
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5. Lentiviral Vector Characterization Made Easy with Maurice CE-SDS。Application Note